Innhold
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) er en laboratorieteknikk som brukes til å skille og identifisere forbindelser. Det er en type kolonnekromatografi som er avhengig av forskjellige polariteter av forbindelser i en løsning for å skille dem. HPLC skiller seg fra standard kolonnekromatografi fordi den bruker trykk for å tvinge løsningen gjennom kolonnen raskere, og derfor gir raskere, og noen ganger mer nøyaktige, resultater. Målet er å skille forbindelser i kolonnen og få dem ut hver for seg.
Coelution
På grunn av hastigheten på HPLC og det er avhengig av forskjellige polariteter av forbindelser, kan to forbindelser med lignende struktur og polariteter forlate kromatografiapparatet på samme tid eller nesten på samme tid. Dette er kjent som coelution. Coelution gjør bestemmelse av nøyaktig hvilken del av blandingen som ble eluert på hvilket tidspunkt som er vanskelig.
Adsorberte forbindelser
HPLC bruker vanligvis en glaskolonne fylt med perler laget av forskjellige materialer. Blandingene som blir presset gjennom kolonnen har kjemikalier som binder seg med forskjellige styrker til perlene. Styrken til bindingen, som avhenger av likheten i polaritet, avgjør hvor lenge kjemikaliet vil binde seg til perlen før den frigjøres. Noen forbindelser binder seg så sterkt at de i det vesentlige aldri frigjøres fra perlene i kolonnen og blir aldri målt i løsningen som kommer ut fra kolonnen.
Koste
Typiske laboratorieseparasjonsteknikker involverer å utvikle en analyse, eller en separasjonsmetode, og deretter implementere denne analysen for å skille individuelle forbindelser fra en løsning. Imidlertid resulterer dette vanligvis i flere løsninger som også må gjennomgå prosedyrer, noe som fører til en eksponentiell økning i kompleksiteten. Selv om HPLC ofte kan forenkle og fremskynde denne prosessen, kan kostnadene for å utvikle et HPLC-apparat bli enorme. Å utvikle et HPLC-apparat, selv om det er mye mer effektivt, er mye mer kostbart enn å utvikle andre assays for å separere forbindelser. Dette gjør det ikke økonomisk levedyktig for mange små privateide laboratorier.
kompleksitet
HPLC brukes ikke bare til å skille enkle forbindelser, den brukes også til å isolere spesifikke proteiner fra en cellulær blanding. I dette tilfellet er perlene i kolonnen vanligvis belagt med et antistoff som er spesifikt for proteinet du trenger å samle. Proteinene binder antistoffene og den gjenværende oppløsningen føres gjennom kolonnen, deretter frigjøres proteinene ved å bruke en annen løsning og samles. Dette krever en dyktig tekniker til å overvåke kolonnen til enhver tid og sørge for at prosessen kjører nøyaktig som planlagt.