Innhold
Ved kjemiske reaksjoner katalysert av et enzym, senker enzymet mengden aktiveringsenergi som kreves ved midlertidig binding med underlaget og vri det til en anstrengt tilstand. K (katalysator) eller "kcat" for reaksjonen refererer til den konsentrasjonsuavhengige konstanten for hastigheten ved hvilken et bestemt enzym kan metabolisere et substrat i et produktmolekyl. For å beregne kcat blander forskere først flere prøverør med varierende konsentrasjoner av underlag (kjent som en "enzymatisk analyse") og tester dem med konstante tidsintervaller med et lett spektrofotometer for å måle de voksende konsentrasjonene av produktmolekyler. Disse dataene blir deretter plottet inn på en graf og analysert.
Beregne starthastigheter
Plasser et diagram over produktkonsentrasjon versus tid for dataene fra det første testrøret med enzymatiske analyser. Merk: den horisontale aksen skal være "tid", og den vertikale aksen skal være "produktkonsentrasjon."
Beregn den lineære regresjonslinjen for datapunktene du planla i seksjon 1, trinn 1. Mens Excel og grafiske kalkulatorer enkelt kan bestemme denne lineære modellen, kan du utlede et estimat av regresjonslinjens helling ved å dele forskjellen i produktkonsentrasjon mellom tilstøtende data poeng etter deres tidsforskjell.
Registrer helningen på den lineære regresjonslinjen fra seksjon 1, trinn 2, som "begynnelsesreaksjonshastighet (Vo)." Merk: i regresjonslinjemodellen "= m + b," er koeffisienten "m" skråningen.
Gjenta trinn 1, 2 og 3 for resten av prøverørene i analysen.
Beregning av Vmax
Plott det inverse av substratkonsentrasjonen for hvert reagensrør kontra det inverse av dets første reaksjonshastighet (fra seksjon 1, trinn 4). Hvis for eksempel hastigheten for et reagensrør med en initial substratkonsentrasjon på 50 mikromolar (uM) var 80 uM / s, ville inversene være 1/50 uM for substratkonsentrasjonen og 1/80 uM / s for den innledende hastighet. Merk: den inverse underlagskonsentrasjonen skal være på den horisontale aksen, og den inverse begynnelseshastigheten skal være på den vertikale aksen.
Merk: underlagskonsentrasjonen skal være på den horisontale aksen, og den første reaksjonshastigheten skal være på den vertikale aksen.
Bestem den lineære regresjonslinjen for diagrammet du tegnet i del 2, trinn 1. Merk: fordi du trenger å kjenne y-skjæringspunktet for regresjonslinjen, bør du oppgi punktene fra del 2, trinn 1 i enten Excel eller en grafregner og bruk den innebygde regresjonsmodelleringsfunksjonaliteten.
Del 1 ved y-krysset fra den lineære regresjonslinjen. Dette vil gi deg verdien av det inverse av Vmax, den maksimale reaksjonshastigheten for enzymet. Merk: Hvis den lineære regresjonsmodellen har formen "= m + b," vil verdien av "b" være y-krysset. Del 1 med "b" for å beregne inverse av Vmax.
Del 1 med resultatet fra avsnitt 2, trinn 3 for å beregne den faktiske verdien av Vmax.
Bestem konsentrasjonen av enzymet i den originale analysen (se rå data). Merk: enzymkonsentrasjonen er den samme for alle prøverørene; bare substratkonsentrasjonene varierer i analysen.
Del Vmax (fra seksjon 2, trinn 4) med enzymkonsentrasjonen (fra seksjon 2, trinn 5). Resultatet er verdien av Kcat.