Innhold
Når du arbeider med høy ytelse væskekromatografi (HPLC), er god kalibrering helt avgjørende for å sikre pålitelige kvalitetsresultater. Riktig kalibrering av et HPLC-instrument begynner med å lage en passende kalibreringsstandard. I de fleste tilfeller krever kalibrering faktisk en rekke standarder for økende konsentrasjon for å produsere det som kalles en kalibreringskurve. Dette er en plottet linje og tilhørende ligning som beskriver forholdet mellom konsentrasjonen av kjemikaliet som testes for og responsen fra HPLC-detektoren.
Bestem kjemikaliet du vil teste for å bruke HPLC ("analytten"). For eksempel kan det være lurt å teste en serie brus for fruktoseinnhold, i hvilket tilfelle fruktose ville være analytten.
Få en mengde av analyttkjemikaliet med passende renhet. Normalt bør renheten være over 99%, og analytten bør kjøpes fra et anerkjent selskap med kjemisk forsyning. Når det gjelder fruktose, vil du for eksempel kjøpe ren fruktose fra en kjemisk leverandør og ikke fra en matbutikk.
Bestem de maksimale og minimum forventede konsentrasjoner av analytten i prøvene du har tenkt å teste på HPLC. Når det gjelder brus, vil du undersøke etikettene til drinkene og bestemme det laveste og høyeste fruktoseinnholdet blant drikkene du vil teste. Husk at den innledende prøven (brus) kan bli fortynnet eller på annen måte manipulert under forberedelse til analyse (avhengig av hvilken HPLC-metode som brukes), og at analytkonsentrasjonen i prøvene som faktisk injiseres på HPLC kan modifiseres. Det er analytkonsentrasjonen i prøvene som kjøres på HPLC som må vurderes.
Bestem løsningsmidlet der du vil oppløse analytten for å utarbeide kalibreringsstandarder. Dette løsningsmidlet må være i stand til å oppløse analytten på riktig måte over et relativt bredt konsentrasjonsområde (minst like høyt som i prøvene du har tenkt å teste). I tillegg bør dette løsningsmidlet ideelt sett være ganske likt den "mobile fasen:" løsningsmidlet som brukes til å føre prøver gjennom HPLC-instrumentet.
Beregn mengden analyt som kreves for å lage en "lagerstandard" -løsning av analytten. Dette blir funnet ved å multiplisere den nødvendige konsentrasjonen av bestandstandarden med ønsket volum. Konsentrasjonen av analytten i denne løsningen skal være minst 10% høyere enn den høyeste forventede prøvekonsentrasjonen. Hvis den høyeste forventede fruktosekonsentrasjonen i en brusprøve er 8 gram / 100 ml, kan bestandsstandarden gjøres til en konsentrasjon på 10 gram fruktose / 100 ml. Et fornuftig volum er 500 ml, og det vil derfor være nødvendig med 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fruktose.
Vei opp den nødvendige mengden analyt til et passende presisjonsnivå. Ofte er en vektverdi i gram nøyaktig til ett eller to desimaler passende, men mer presisjon kan være nødvendig for noen metoder.
Overfør den veide analytten til en volumetrisk kolbe med nødvendig volum og tilsett ønsket oppløsningsmiddel til fyllmerket på kolben. Bruk av en volumetrisk kolbe (i stedet for et gradert begerglass, for eksempel) øker presisjonen for bestandstandens konsentrasjonsverdi. Forsikre deg om at all analyt blir overført til kolben. bruk noe av løsemidlet for å vaske det inn, om nødvendig.
Tapp den volumetriske kolben og rist forsiktig eller inverter til analytten er fullstendig oppløst.
Lag en serie med forskjellige fortynninger av bestandstandarden ved å overføre kjente volumer av stamstandarden til volumetriske kolber, bruk pipetter for nøyaktig overføring og deretter tilsett løsningsmiddel. Den laveste standardkonsentrasjonen bør være under den laveste forventede prøven som skal analyseres. I bruseksemplet, hvis den laveste forventede fruktosekonsentrasjonen i en prøve er 2 gram / 100 ml, kan en standard på 1 gram / 100 ml bli laget. Dette ville bli gjort ved en tidobbelt fortynning av aksjestandarden. Standardserien bør inneholde totalt 5 eller 6 konsentrasjoner, slik at ytterligere fortynninger for å produsere standarder på 3, 5 og 8 gram fruktose / ml ville være nødvendig. Du har nå en serie standardløsninger for å kalibrere HPLC.