Innhold
En celles genetiske blå er kodet i dets genetiske materiale, eller DNA. Siden DNA aldri forlater cellekjernen, er det nødvendig å transkribere DNAet til messenger RNA (mRNA eller poly (A) RNA) for å få denne informasjonen til å komme inn i cytoplasmaen der andre proteiner og biokjemiske komponenter befinner seg. Dette mRNA blir deretter oversatt til proteiner som utfører mange funksjoner i cellen. For å oppdage eller kvantifisere veldig sjeldne mRNAer, lage sonder for mikroarrayer eller konstruere biblioteker med komplementære DNA-molekyler, mRNA må isoleres. Imidlertid er total RNA (dvs. all RNA i en celle) ekstraksjon og etterfølgende mRNA-isolasjon ikke gjensidig utelukkende prosesser; førstnevnte må utføres for at mRNA kan bli ekstrahert.
Isolering av mRNA fra total RNA
TRIzol-homogenisering: Total RNA inkluderer alt mRNA, overførings-RNA, ribosomalt RNA og andre ikke-kodende RNAer. For å skille disse fra andre cellulære komponenter, blir cellen først brast åpen for å frigjøre innholdet. Dette gjøres ved å resuspendere celler pelletert ved sentrifugering (spinning i høye hastigheter) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andre versjoner av TRIzol (for eksempel Ambions TRI-reagens) fungerer på samme måte.
Total RNA-isolasjon: En serie sentrifugeringer brukes for å skille de forskjellige komponentene (proteiner, DNA, RNA) av cellen i lag, eller faser, i suspensjonen. Den øverste, gulfargede fasen er sammensatt av fett og kan kastes. Den ønskede fasen er tonet rød, inneholder total RNA og blir beholdt. Etter å ha utført en fenol-kloroformekstraksjon og en serie alkoholvasker ved å bruke isopropanol og etanol, kan RNA pelleteres for mRNA-isolering. Tilsett RNase-hemmere for å forhindre at dette enzymet ødelegger det totale RNA.
mRNA-ekstraksjon: Det er vanlig å bruke et sett for å isolere mRNA-er, ettersom hjemmelagde laboratorieprotokoller ikke genererer store mengder høyt renset mRNA-er. Kommersielle sett inkluderer Invitrogen's FastTrack 2.0 eller Ambions Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Disse grunnleggende trinnene er vanlige for slike sett:
a) Bland den RNase-inhiberte lysebufferen som ble levert i settet med opptil 300 mikroliter totalt RNA.
b) Varm opp i 5 minutter ved 65 grader og avkjøl deretter prøven umiddelbart på is i ett minutt.
c) Bland dette med 0,5M natriumklorid, og oppløs deretter Oligo dT (oligodeoxythymidylic acid) i denne prøven.
d) Sentrifuger denne prøven og gjenvinne supernatanten, som vaskes flere ganger i en serie bindende og lave saltbuffere tilveiebragt i settene.
e) Eluer mRNA flere ganger til et sett-spesifisert volum (f.eks. 500 mikroliter) er oppnådd.
f) Presipiter eluatet med natriumacetat og etanolutfelling. Suspendér igjen i opptil 20 mikroliter dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlet vann.
g) Oppbevares ved -80 grader celsius og sjekk for kvalitet og mengde ved hjelp av spektrofotometri.