Innhold
Kvantifiser RNA-prøven din ved å måle absorbansen av ultrafiolett lys (UV). Et nano-drop spektrofotometer bruker bare en eller to mikroliter av prøven din, som du kan gjenopprette. Andre spektrofotometre krever en mye større prøve. Ekstinksjonskoeffisienten for nukleotider med en UV-bølgelengde på 260 nm i en 1 cm lett bane er 20. Basert på denne ekstinksjonskoeffisienten er absorbansen av 40 ug / ml RNA under de samme betingelser en. Ved hjelp av denne informasjonen kan du beregne konsentrasjonen av RNA-prøven.
Gjør en fortynning, om nødvendig, av prøven. En standard fortynning for en mikrokuvett er 1:40. Gjør denne fortynningen ved å tilsette 2 uL RNA-prøve til 78 ul sterilt vann.
Følg protokollene til ditt spesielle spektrofotometer for å kalibrere maskinen ved å bruke en blank, og bestem deretter den optiske tettheten til prøven med en UV-bølgelengde på 260 nm.
Multipliser absorbansen av prøven din med fortynningsfaktoren med 40μg RNA / ml. Ligningen vil være: “RNA-konsentrasjon (µg / ml) = (OD260) x (fortynningsfaktor) x (40 ug RNA / ml) / (1 OD260 enhet)” (Hofstra.edu) For eksempel: Hvis du fortynnet prøven med 1:40, og absorbansavlesningen din var 0,08, ville du multiplisert 0,08 x 40 x 40 = 128 ug / ml = 0,13 µg / ul
Regn ut renheten til prøven din ved å ta en ny absorbansavlesning ved UV-bølgelengde på 280 nm. Forholdet OD 260 / OD 280 vil indikere om - og på hvilket nivå - prøven er forurenset med protein eller fenol. Et resultat fra 1,8 til 2,0 indikerer RNA av kvalitet.