Innhold
Polymerasekjedereaksjon, eller PCR, er en teknikk som fotokopierer et fragment av DNA i mange fragmenter - eksponentielt mange. Det første trinnet i PCR er å varme opp DNA slik at det denaturerer, eller smelter i enkeltstrenger. Strukturen til DNA er som en taustige der rungene er tau med magnetiske ender. Magnetene kobles sammen for å danne lungene, kalt basepar, og motstår dermed å bli trukket fra hverandre. Hvert fragment av DNA smelter i enkeltstrenger ved forskjellige temperaturer. Å forstå hvordan DNA-strukturen holdes sammen av DNAs enkeltdeler vil gi innsikt i hvorfor forskjellige DNA-fragmenter smelter ved forskjellige temperaturer og hvorfor så høye temperaturer er nødvendig i utgangspunktet.
Smelte! Smelte!
Det første trinnet med PCR er å smelte DNAet slik at dobbeltstrenget DNA skilles ut i enkeltstrenget DNA. For pattedyr-DNA involverer dette første trinnet vanligvis varme på omtrent 95 grader Celcius (ca. 200 Fahrenheit). Ved denne temperaturen binder hydrogenbindingene mellom A-T- og G-C-baseparene, eller trinnene i DNA-stigen, hverandre, og løsner det dobbelttrengede DNA-et. Temperaturen er imidlertid ikke varm nok til å bryte fosfat-sukkerryggraden som danner de enkelte trådene, eller stengene på stigen. Fullstendig separasjon av enkeltstrenger forbereder dem for det andre trinnet av PCR, som avkjøles for å la korte DNA-fragmenter, kalt primere, binde enkeltstrengene.
Magnetiske glidelåser
En grunn til at DNA varmes opp til den høye temperaturen på 95 grader er at jo lengre DNA-streng er, jo mer ønsker den å holde seg sammen. DNA-lengde er en faktor som påvirker smeltepunktet som er valgt for PCR på det stykke DNA. A-T- og G-C-baseparene i den dobbeltstrengede DNA-bindingen med hverandre for å holde dobbeltstrengestrukturen sammen. Jo mer sammenhengende basepar mellom to enkeltstrenger har limt seg, jo mer ønsker naboer også å binde seg, og jo sterkere blir tiltrekningen mellom de to strengene. Det er som en glidelås laget av små magneter. Når du lukker glidelåsen, vil magnetene naturligvis ønske å glippe og bli glidelås.
Sterkere magneter klistres mer tett
En annen faktor som påvirker hvilken smeltetemperatur du vil velge for ditt DNA-fragment av interesse er mengden G-C basepar som er til stede i det fragmentet. Hvert basepar er som to minimagneter som tiltrekker seg. Et par laget av G og C er mye sterkere tiltrukket enn et A- og T-par. Dermed vil et stykke DNA som har flere G-C-par enn et annet fragment kreve en høyere temperatur før det smeltes i enkeltstrenger. DNA absorberer naturlig ultrafiolett lys - med en bølgelengde på 260 nanometer for å være nøyaktig - og enkeltstrenget DNA absorberer mer lys enn dobbeltstrenget DNA. Så å måle mengden lys som er absorbert er en måte å måle hvor mye dobbeltstrenget DNA har smeltet i enkeltstrenger. Den "magnetiske glidelås" -effekten av G-C- og A-T-basepar er det som får en graf over lysabsorberingen av dobbeltstrenget DNA plottet mot en økning i temperaturen til å være sigmoidal, formet som en S, og ikke en rett linje. S-kurven representerer teamarbeidets motstand som baseparene utøver mot varmen fordi de ikke vil skille seg.
The Halfway Point
Temperaturen som en lengde av DNA smelter i enkeltstrenger kalles dens smeltetemperatur, som er betegnet med forkortelsen "Tm." Dette indikerer temperaturen hvor halve DNAet i en løsning har smeltet til enkeltstrenger og den andre halvparten er fremdeles i dobbeltstrenget form. Smeltetemperaturen er forskjellig for hvert fragment av DNA. Pattedyr-DNA har et G-C-innhold på 40%, noe som betyr at de resterende 60% av baseparene er As og Ts. Dens 40% G-C-innhold får pattedyr-DNA til å smelte ved 87 grader Celcius (ca. 189 Fahrenheit). Dette er grunnen til at det første trinnet med PCR på pattedyr-DNA er å varme det opp til 94 grader Celcius (201 Fahrenheit). Bare syv grader varmere enn smeltetemperaturen og alle doble tråder vil smelte helt til enkeltstrenger.