Innhold
- Hva er gelelektroforese?
- Komponenter av elektroforese
- Støpe gelen
- Hvordan fungerer elektroforese?
- Lading og størrelse Bestem DNA-båndene
- Bruksområder og bruk av elektroforese
Gelelektroforese, ofte også kalt DNA-elektroforese eller ganske enkelt elektroforese, er en teknikk som brukes til å skille fragmenter av DNA (og andre ladede molekyler) i henhold til størrelse. Dette gjøres vanligvis ved bruk av agarosegel og elektrisk ladning for å skille fragmenter fra hverandre.
Denne teknikken har noen få anvendelser, inkludert undersøkelse av DNA, DNA-fingring, kriminologi og forskjellige medisinske applikasjoner også.
Hva er gelelektroforese?
Gelelektroforese er en teknikk som lar forskere skille ladede molekyler i henhold til størrelse. Dette inkluderer DNA, RNA og proteiner.
Husk at DNA og RNA har en liten negativ ladning takket være negativt ladede oksygenmolekyler i sukkerfosfatryggraden i molekylet. Proteiner kan ha en rekke ladninger avhengig av aminosyrene i polypeptidkjeden.
Komponenter av elektroforese
For å utføre elektroforese, må først gelen lages. Dette kan gjøres i nesten alle laboratorier; agarosegeler er vanligst. For å lage gelen blandes agarosepulver med en spesiell buffer som kalles elektroforesebuffer. Denne blandingen blir deretter oppvarmet til agarosen er oppløst og fullstendig blandet i bufferløsningen.
Merk at noen elektroforeseprotokoller krever tilsetning av etidiumbromid (Et-Br). Dette flekker alt DNA som brukes i elektroforese, slik at du kan se plasseringen av fragmentene under UV-lys.
Støpe gelen
Dette helles deretter i en rektangulær form som kalles et gelstøpt brett. Sammen med formen som skaper den rektangulære gelen som brukes til elektroforese, plasseres en kam i en av endene av gelen. Denne kammen lager brønnene der prøvene du ønsker å skille via elektroforese lastes. Du kan se et bilde her.
Når gelen har herdet, fjernes brønnkammen og gelen legges i en spesiell elektroforesetank. En annen buffer fylles i tanken til et lite lag med buffer fullstendig dekker agarosegelen.
Denne tanken produserer en elektrisk strøm (fra 50 til 150 V) gjennom bufferløsningen og i sin tur gjennom agarosegelen. Agarosegelens brønner er plassert i den negative enden av strømmen ( katoden) med den andre enden av gelen i den positive enden av strømmen anode).
Hvordan fungerer elektroforese?
Før den elektriske strømmen kjøres gjennom tanken og gelen, blir prøvene dine lastet inn i brønnene. Dette gjøres ved hjelp av en mikropipette. En "markør" -prøve, også kjent som en DNA-stige, er en prøve med kjente DNA-fragmentstørrelser som kan hjelpe deg med å sammenligne prøvene dine og forstå størrelsene på prøven du tester.
Ofte a sporing fargestoff (også kalt et lastingsfargestoff) blir lagt til hver prøve for å hjelpe deg med å laste prøven i brønnene. Fargestoffet hjelper deg også med å spore bevegelsen av prøvene gjennom gelen.
Så hvordan beveger prøvene seg faktisk gjennom gelen og skiller seg etter størrelse? Det har med elektrisk strøm som går gjennom agarosegelen sammen med størrelse / struktur på fragmentene og agarosegel.
Lading og størrelse Bestem DNA-båndene
Husk at DNA-ladningen totalt sett er negativ . Så når disse prøvene plasseres i brønner som ligger nær den negative enden av den elektriske strømmen, vil dette føre til at negativt ladet DNA beveger seg vekk fra katoden (negativ ladning) og flytt mot anoden (positiv ladning) i motsatt ende.
Foruten denne bevegelsen av prøvene, skiller elektroforese også prøvene og fragmentene i disse prøvene etter størrelse. Dette er fordi mindre molekyler og fragmenter kan Beveg deg fortere og lettere gjennom gelen mens større molekyler og fragmenter gå saktere. Dette betyr at små fragmenter vil bevege seg til enden av gelen raskere enn større, og som et resultat separerer hvert fragment etter størrelse.
Etter at gelen er kjørt i omtrent en time (i de fleste protokoller), slås ladningen av og gelen analyseres. Du ser et tydelig rektangulært bånd, ofte kalt DNA-båndet eller proteinbåndet, på forskjellige punkter langs gelen. Hvert bånd representerer ett fragment som har beveget seg langs gelen.
Bruksområder og bruk av elektroforese
Det er mange bruksområder for elektroforese på laboratoriet. Her er bare noen få: