Innhold
Gelelektroforese er en teknikk som gjør det mulig å analysere DNA på nivået med dets bestående molekyler. I denne DNA-visualiseringsmetoden plasseres prøver på et agarosegelemedium og et elektrisk felt tilføres gelen. Dette får fragmenter av DNA til å migrere gjennom gelen i forskjellige hastigheter i samsvar med deres elektrokjemiske egenskaper.
Ethidium Bromide
For denne visualiseringsteknikken blandes etidiumbromid med agarosepulver, EDTA-buffer og vann for å danne gelmatriksen før elektroforese. Som et resultat blir etidiumbromidmolekylene jevnt spredt i hele matrisen. Når gelbrønnene er blitt fylt med sine respektive DNA-prøver og sporingsfargestoffer, påføres spenning for sakte å trekke de store, polare forbindelsene over matrisen.
Under denne bevegelsen bindes basene til DNA-molekylene midlertidig til partiklene takket være etidiumbromidladningen og drar dem med. Når gelelektroforesen er fullført, har hvert DNA-molekyl plukket opp til en betydelig mengde etidiumbromid.
I nærvær av ultrafiolett lys viser etidiumbromid fluorescens. Teknikere skinner et spesielt kalibrert UV-lys over gelen mens en maskin fanger bildet av de glødende fragmentene.
Metylenblått
Hvis en UV-transilluminator ikke er tilgjengelig eller praktisk, kan teknikere synliggjøre DNA under normal tilstand ved å bløtlegge den ferdige agarosegel med elektroforesert DNA inne i en løsning av metylenblått over natten.
Et kloridsalt med et betydelig hydrofobt anion, metylenblå molekyler trenger gjennom hele gelmatrisen. Imidlertid fører hydrogenbinding gjennom DNA til at flekkmolekylene akkumuleres. Denne økte DNA-flekkdensiteten gir en dypere nyanse av blått, synlig for det blotte øye.
Sporing av fargestoffer
Utover den relative størrelsen på DNA-båndene, kan teknikere måle den absolutte størrelsen (i basepar) av hvert fragment ved å bruke kjemikalier som kalles sporingsfargestoffer. Synlig uten tilsetning av metylenblått eller etidiumbromid, sporingsfargestoffer som bromfenolblått og xylencyanol beveger seg over aragosegelmatrisene under elektroforese med samme hastighet som DNA-fragmenter bestående av henholdsvis 300 nukleotider og 4000 nukleotider. Ved elektroforese reiser mer massive DNA-fragmenter over gelmatrisen med en lavere hastighet enn mindre fragmenter. Mens sporing av fargestoffer ikke påvirker synligheten av DNA-fragmenter direkte, gjør det mulig å sammenligne posisjonen til et DNA-fragment i gelen med plasseringen av disse fargestoffene teknikere å "se" det omtrentlige antallet nukleotider DNA-fragmentet inneholder.