Innhold
Ved gelelektroforese blir prøver av DNA eller proteiner separert - typisk basert på størrelse - ved å bruke et elektrisk felt som får dem til å vandre gjennom en gel. Bruken av gelelektroforese er rutinemessig i biomedisinske forskningslaboratorier og brukes til å svare på en rekke forskjellige spørsmål, så det er ikke en universell måte å analysere resultatene på.
Ulike teknikker som for eksempel western blotting, Northern blotting og Southern blotting, involverer for eksempel gelelektroforese.
Hvis du gjør agarosegelelektroforese av DNA-prøver, den vanligste typen prosedyre, må du vanligvis gjøre minst to ting: 1) skille uklippede plasmider fra innsatser, hakkede plasmider og kuttede plasmider, og 2) estimere størrelsen på de forskjellige DNA-fragmenter med en standardkurve Excel eller kalkulator.
Her er hvordan det fungerer.
Sjekk din bærbare datamaskin for å finne ut hvilke prøver som ble lagt inn i hvilke baner. Når du lastet brønnene for gelen din, skal du ha registrert identiteten til hver bane / prøve.
Bestem hvilken bane som inneholder "stigen" av DNA-standarder. Dette er fragmenter med kjent lengde; migrasjonsavstanden deres kan brukes til å bestemme størrelsen på prøvefragmentene ved å bruke en standardkurve Excel eller en annen kalkulator.
Bruk en linjal til å måle avstanden på bildet ditt fra brønnene til sporingsfargestoffet, som vil ha reist lenger enn noen av DNA-båndene (med andre ord, det vil være i bunnen av gelen). Skriv inn dette nummeret - enhetene du bruker er ikke viktige.
Mål avstanden på bildet ditt fra brønnene til hvert av båndene i "stigen", og del deretter avstanden med avstanden som er sporet av sporingsfargestoffet. Denne beregningen gir deg den relative mobiliteten til hvert band.
Eksempel: Anta at sporingsfargestoffet reiste 6 tommer, og vi har tre band som reiste 5, 4,5 og 3,5 tommer.
Hva er deres relative mobilitet? Svar: Vi deler 5, 4.5 og 3.5 med 6 for å oppnå relative mobiliteter på 0,833, 0,75 og 0,5833.
Legg inn de relative mobilitetene i regnearksprogrammet ditt (Excel eller et annet lignende program som du bruker) sammen med størrelsen i kilobaser av hvert fragment i stigen.
Produsenten gir deg størrelsen på hvert fragment i stiger de leverer, så du bør allerede ha denne informasjonen.
Grafer dataene med relativ mobilitet på x og størrelse i kilobaser på y.
Bruk Trendline-funksjonen i regnearksprogrammet ditt for å passe en ligning til dataene. Denne ligningen skal være en kraftligning (f.eks. X ^ -2) og skal passe dataene relativt godt (R-koeffisient på minst 0,9). Dette oppretter en kurve og en standardkurve Excel.
Se på bandene som tilsvarer prøvene dine.
Husk at mindre DNA-fragmenter beveger seg lenger gjennom gelen enn store DNA-fragmenter, så de nærmest sporingsfargestoffet vil være de minste. Vær imidlertid oppmerksom på at hvis plasmid (sirkulært) DNA er uklippet, vil det bli "supercoiled" eller vridd som en telefonsnor, noe som faktisk vil føre til at det reiser lenger enn lineært DNA av samme størrelse.
På samme måte vil et "hakket" plasmid som er blitt fullstendig kuttet reise a kortere avstand enn lineært DNA av samme størrelse. Følgelig kan du ikke estimere størrelsen på uklippede plasmider fra gelen din.
Match båndene i hver bane med identiteten til prøven du lastet i den banen, og finn ut om det du ser er det du ville forventet. Dette vil avhenge av eksperimentets art.
Generelt, men hvis du fordøyet et innsatsplasmid med to restriksjonsenzymer, ville du imidlertid forvente at innsetningen vil bli frigjort fra plasmidet.
Siden det er mye mindre enn plasmidet, kan du forvente å se to bånd i den banen, det ene nær toppen og det andre nede i bunnen. Et plasmid som er kuttet med bare ett restriksjonsenzym, bør bare danne et enkelt bånd som beveger seg litt lenger enn plasmidet som er kuttet med to restriksjonsenzymer, men ikke i nærheten så langt som innlegget.
Mål avstanden fra brønnene til det kuttede plasmidet og sett inn bånd med linjalen din. Del disse tallene etter den avstanden som sporingsfargestoffet har tilbrakt for å finne relativ mobilitet av innlegg og kuttede plasmider.
Plugg den relative bevegeligheten til innlegg og kutt plasmider i ligningen regnearksprogrammet ditt beregnet for deg. Denne beregningen skal gi deg et estimat på størrelsen på disse plasmidene.