Innhold
- Fordel: Følsomhet
- Fordel: Spesifisitet
- Ulempe: utsatt for falske eller subjektive resultater
- Ulempe: høye kostnader og teknisk etterspørsel
Western blot, en analytisk teknikk brukt for å finne et spesifikt protein i en gitt prøve, benytter evnen til et enzym eller fluorescensmerket primært antistoff til å binde seg til dets spesifikke antigen. Det er en tretrinnsprosess som begynner med gelelektroforese, etterfulgt av membranblotting og sondering med antistoffer. Proteindeteksjon kan være direkte eller indirekte, mens sistnevnte bruker et merket sekundært antistoff rettet mot det primære. Selv om det er akseptert som en rutinemessig proteinanalyseteknikk, har western blot begrensninger og fordeler.
Fordel: Følsomhet
Et av de største argumentene til fordel for western blot er dens følsomhet. På grunn av dens evne til å påvise så lite som 0,1 nanogram protein i en prøve, kan teknikken teoretisk tjene som et effektivt tidlig diagnostisk verktøy, og detektere selv den minste immunogene respons fra et virus eller bakterier i en pasientprøve. En indirekte westernblot bygger videre på denne følsomheten fra det sekundære antistoffets evne til å forsterke intensiteten til signalet som detekteres av bildesystemet. Større følsomhet betyr at færre antistoffer er nødvendige for testing, noe som reduserer laboratoriekostnadene betydelig.
Fordel: Spesifisitet
Western blot-teknikken skylder sin egenart til to store medvirkende faktorer. Først sorterer gelelektroforese en prøve i proteiner av forskjellig størrelse, ladning og konformasjon. Denne prosessen er i seg selv et stort skritt mot deteksjon, da bånd dannet i gelen allerede gir ledetråder omtrent størrelsen på proteinet eller polypeptidet av interesse. Spesifisiteten til antistoff-antigen-interaksjonen fungerer som den andre store faktoren. Fordi spesifikke antistoffer viser affinitet for spesifikke proteiner, kan prosessen selektivt påvise et målprotein selv i en blanding av 300 000 forskjellige proteiner.
Ulempe: utsatt for falske eller subjektive resultater
Til tross for følsomhet og spesifisitet, kan en vestlig blot fremdeles gi feilaktige resultater. Et falskt-positivt resultat når et antistoff reagerer med et ikke-tilsiktet protein, og det er det som ofte skjer når en pasient som testes for HIV tilfeldigvis har tuberkulose eller en rekke parasittinfeksjoner. En falsk-negativ, derimot, kan lett resultere hvis større proteiner ikke gis tilstrekkelig tid til å overføres ordentlig til membranen. Ukorrekt blotting og prosessering produserer ofte skjevt, falmet eller til og med flere bånd, noe som gjør testresultatene underlagt tolkningen av teknikeren.
Ulempe: høye kostnader og teknisk etterspørsel
Kostnaden for en western blot er en sammensatt av de store individuelle utgiftene for taggede antistoffer, dyktige analytikere og laboratorieutstyr. En delikat prosess, vestlig blotting, krever presisjon i hvert trinn for korrekt identifisering av prøvenes bestanddeler. En mindre feil i reagenskonsentrasjonen eller i inkubasjonsperioden kan være katastrofalt for hele prosessen. Endelig kan utstyret som kreves for deteksjon og avbildning - kjemiluminescerende, fluorescerende, radioaktive eller laserdeteksjonssystemer - være for dyrt for den gjennomsnittlige mikrobiologiske enheten.