Innhold
Gram-flekken er en forskjellig fargeprosedyre som viser hvilke bakterier som er Gram-positive eller Gram-negative basert på fargefarget. Acetonalkohol er et reagens som brukes i denne prosessen for å gi fargedifferensiering. Gram-positive bakterier har et tykt peptidoglykansk lag og flekker lilla, mens gramnegative mikroorganismer har et lite til ingen peptidoglykansk lag og flekkerosa.
Primær flekk-krystallfiolett
Når et lysbilde av bakterieprøven er tilberedt, blir krystallfiolett brukt til å farge prøven først. På dette tidspunktet vil både gram-positive og gram-negative bakterier virke lilla. Vanligvis påføres krystallfiolett på lysbildet i 30 sekunder før du vasker overflødig flekk med vann. Krystallfiolen kan feste seg litt til de peptidoglykanske lagene, slik at ikke all den primære flekken blir vasket av med vannet.
Mordant-Jod
Jod tilsettes deretter prøven i ett minutt. Det fungerer som en mordant, som tjener til å fikse fargestoffer i en fargeprosess. Jod utfører denne funksjonen ved å binde seg til den krystallfiolette og lage et uoppløselig kompleks som fester seg mye bedre til det tykke peptidoglykansk laget som finnes i gram-positive bakterieceller enn bare den krystallfiolette alene. Det er ikke et vasketrinn med vann etter tilsetning av jod.
Decolorizer-Alkohol
Enten aceton eller etylalkohol kan brukes som fargestoffer. Alkoholen løser opp lipider som finnes i den ytre cellemembranen av gramnegative bakterier, og lar krystallfiolett-jodkomplekset lekke ut av det tynnere peptidoglykansk laget. Alkoholen tilsettes i 10 til 20 sekunder; den helles på lysbildet til all jod er vasket bort og avrenningen er fargeløs. På dette tidspunktet i Gram-flekkeprosessen er gramnegative bakterier fargeløse mens Gram-positive bakterier fortsatt beholder krystallfiolen. Når lysbildet er ferdig skyllet, må det skylles med vann for å stoppe avfargingseffekten.
Motfarge-safranin
Safranin tilsettes deretter for å øke synligheten og kontrasten til de fargeløse Gram-negative bakteriene. Flekken får disse bakteriene til å virke rosa under mikroskopet. Siden flekken er tilsatt hele prøven, farger den også gram-positive bakterier, men den mørkere av krystallfiolett skjuler den lysere safraninrosa fargen. Når lysbildeprøven er blitt oversvømmet med safranin i omtrent et minutt, brukes vann til å vaske bort overflødig flekk som ikke fester seg til bakteriecellene.