Innhold
Western blotting er en av de vanligste prosedyrene i biokjemiske laboratorier. I utgangspunktet skiller den proteiner fra en prøve etter størrelse, og tester deretter ved bruk av antistoffer for å bestemme om et gitt protein er til stede. Det er nyttig ikke bare i forskning, men også i medisinske eller diagnostiske laboratorier; tester for både HIV og Lyme sykdom, for eksempel involverer en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) test, etterfulgt av en Western blot hvis ELISA tester positiv. Til tross for populariteten har imidlertid vestlig blotting flere ulemper.
Nonquantitative
Klassiske vestlige blots er ikke-kvantitative. Med andre ord, mens de kan fortelle forskere om et bestemt protein er til stede, gjør de det ikke mulig å kvantifisere hvor mye av proteinet som er til stede. Noen bioteknologiselskaper selger nå sett som gjør det mulig for forskere eller laboratorietekniker å kvantifisere mengden protein som er til stede ved hjelp av en standardkurve - men dette fungerer bare hvis rene prøver av samme protein er tilgjengelige. Dessuten kan molekylvekten til et protein bare estimeres med vestlig blotting, snarere enn bestemt nøyaktig som med massespektrometri.
antistoffer
En Western blot kan bare utføres hvis primære antistoffer mot proteinet av interesse er tilgjengelige. Mens antistoffer for mange forskjellige proteiner er tilgjengelige fra bioteknologiselskaper, er de ikke billige; hvis primære antistoffer ikke er tilgjengelige for et gitt protein, vil det ikke være mulig å utføre en Western blot som leter etter det aktuelle proteinet. Videre vil forskere kanskje bestemme om et protein har blitt modifisert på noen måte - hvis det har blitt fosforylert (hvis en fosfatgruppe var knyttet til det), for eksempel - og med Western blot-teknikken trenger de antistoffer som er spesifikke for den modifiserte protein.
Trening
Det kan være utfordrende å utføre en Western blot riktig og få gode resultater, så personalet må være godt trent.I dette som i mye annet er erfaring kanskje den beste veilederen; selv for en erfaren tekniker er imidlertid en Western blot tidkrevende. For eksempel vil gelelektroforesedelen av eksperimentet vanligvis ta fra en til to timer å kjøre. Andre oppgaver kan selvfølgelig utføres mens gelen kjører, men eksperimentet tar fortsatt ganske lang tid å få resultater.
Andre begrensninger
Antistoffer kan noen ganger utvise noe utenfor målet, noe som kan gi dårligere resultater. Med Western blotting bruker du dessuten et antistoff mot et spesifikt protein, så resultatene dine vil bare fortelle deg om det proteinet var til stede. I motsetning avslører massespektrometri med høy oppløsning alle proteiner som er til stede i en prøve, og i motsetning til klassisk westernblotting er den kvantitativ. Det er viktig å huske, selvfølgelig, at massespektrometri er mye dyrere og også mer teknisk utfordrende å bruke sammenlignet med vestlig blotting.