Innhold
- TL; DR (for lang; ikke lest)
- Buffer og salt
- Oppløsende vaskemidler
- Chelateringsmidler og hemmere
- Alkalisk lysis
Lyse er et ord som kommer fra gresk og betyr bare "å splitte" eller "å sprekke." Helt klart gjelder begrepene hva som skjer med celler i en lysebuffer, en løsning som bryter dem åpne for å trekke ut innholdet. Forskere bruker lysebuffere når de trekker ut DNA eller proteiner fra celler for analyse, spesielt når det gjelder bakterier. Typen cellelysebuffer varierer avhengig av type eksperiment, selv om følgende er noen vanlige valg.
TL; DR (for lang; ikke lest)
Lysisbuffere hjelper til med å bryte åpne celler, slik at innholdet kan nås eller fjernes. Noen eksempler inkluderer salter, vaskemidler, chelateringsmidler og hemmere, og noen alkaliske kjemikalier.
Buffer og salt
Buffere stabiliserer pH mens cellene splittes. Tris-HCL er et av de vanligste kjemikaliene for buffring ved pH 8. HEPES er et annet vanlig bufferkjemisk stoff i disse eksperimentene. Natriumkloridsalt kan også øke ionestyrken, den totale konsentrasjonen av oppløste stoffer utenfor cellene. Dette siste punktet har en viss betydning siden vann kan diffundere over cellemembraner fra områder med lav konsentrasjon av løst stoff til regioner med høy konsentrasjon av løst stoff.
Oppløsende vaskemidler
Vaskemidler løser opp cellemembraner slik at innholdet i celler kan slippe ut. Den har og den amfipatiske molekylstrukturen (dvs. molekyler med den ene enden som samvirker lett med vannmolekyler, mens den andre hydrofobe eller "vannfryktige" enden ikke gjør det). De kan løse opp fett ved å danne miceller, små klynger der de hydrofobe halene i vaskemiddelmolekylene peker innover mot fettmolekylene. Vanlige vaskemidler inkluderer natriumdodecylsulfat, eller SDS, NP-40 og tritonX.
Chelateringsmidler og hemmere
Lysisbuffere inkluderer typisk også chelateringsmidler som etylendiaminetetraeddiksyre (EDTA) eller etylenglykoltetraeddiksyre (EGTA). Disse kjemikaliene binder seg til metallioner med to positive ladninger (f.eks. Magnesium og kalsium), og gjør dem dermed utilgjengelige for andre reaksjoner. Mange DNA-proteiner (proteiner som tygger opp DNA) og proteaser (proteiner som skiver opp andre proteiner) trenger magnesiumioner for å fungere, så ved å frata dem denne sentrale ingrediensen, bidrar EDTA og EGTA til å redusere nivået av protease eller DNAse-aktivitet. De utelukker det imidlertid ikke helt, og noen proteaser er ikke avhengige av magnesiumsofaktorer, så lysbuffere inkluderer noen ganger også kjemikalier som kalles proteasehemmere, som binder seg til proteaser og forhindrer dem i å fungere ordentlig.
Alkalisk lysis
Alkalisk lysis, en veldig vanlig teknikk for rensing av plasmider fra bakterier, involverer tre løsninger. Den første inneholder glukose, tris-HCL-buffer, EDTA og RNA. Glukosen skaper en høy konsentrasjon av løsemidler utenfor bakteriene, slik at de blir litt slapp, noe som gjør dem lettere å lysse. EDTA og tris-HCL fungerer som allerede beskrevet, mens RNAse vil tygge opp eventuelt RNA inne i cellen for å få den ut av veien. Den andre løsningen lyserer faktisk cellene. Denne inneholder SDS-vaskemiddel og NaOH, som hever pH til 12 eller over, denaturerer proteiner inne i cellen og får DNA til å skilles ut i enkeltstrenger. Den tredje løsningen inneholder kaliumacetat for å gjenopprette pH til et mer nøytralt nivå, slik at plasmid-DNA-strengene kan komme sammen igjen. I mellomtiden klumper de denaturerte proteiner seg opp og utfeller, mens dodecylsulfationene kommer sammen med kaliumionene for å danne en uoppløselig forbindelse, som også utfelles fra oppløsningen.