Innhold
- Hvordan gelelektroforese fungerer
- En grunnleggende elektroforeseprosedyre
- Bestemme lengder av ukjente fragmenter
Når det gjelder å måle lengden på DNA-fragmenter, som er mye mindre enn celler, trenger mikrobiologer et triks, og det mest praktiske er gelelektroforese. Denne metoden er avhengig av at DNA-fragmenter er ladet, og det er et alternativ til dyrere metoder, for eksempel røntgenkrystallografi, som var ansvarlig for oppdagelsen av dobbelt-helix-strukturen til DNA.
Hvordan gelelektroforese fungerer
Fordi DNA-molekyler lades, påvirkes de av en elektrisk strøm. Når du setter dem i en nøytral gel og plasserer en strøm over gelen, migrerer molekylene mot den positive elektroden (anoden). Fordi DNA-molekyler i forskjellige størrelser har samme ladning, reiser de mindre raskere, så denne prosessen skiller molekylene i bånd som kan sammenlignes med prøver av kjente størrelser.
En grunnleggende elektroforeseprosedyre
Gelen er vanligvis laget av agarose, et polysakkarid som ved oppvarming i en bufferoppløsning danner en halvfast, svakt porøs gel. I den ene enden danner gelen ørsmå fordypninger kalt brønner der forskeren plasserer DNA-prøvene som er undersøkt, sammen med referanseprøver av kjent lengde, kalt en DNA-stige. Lengdene på stigefragmentene er forhåndsbestemt med en annen metode, for eksempel røntgenkrystallografi.
Når gelen er nedsenket i en ledende løsning og spenning påføres, begynner fragmentene å vandre gjennom gelen - de mindre først og de større, saktere bak. De danner seg etter hvert til spektrallignende band etter størrelse.
Når dette skjer, skrur forskeren strømmen, tilfører gelen med et DVA-bindende fargestoff og undersøker prøvene under ultrafiolett lys. Ved å bruke stigen som referanse, kan forskeren bestemme størrelsen på hvert av fragmentene i et synlig bånd. Bare bånd er synlige - individuelle DNA-fragmenter er for små til å se.
Bestemme lengder av ukjente fragmenter
Sjansene er ikke hvert bånd i et utvalg sammen med et bånd på stigen, så for å bestemme størrelsene på disse ukjente fragmentene plottes forskere vanligvis en graf. På x-aksen er avstanden tilbakelagt av hvert bånd i stigen i millimeter, mens på y-aksen er størrelsen på hvert bånd. Når punktene er koblet sammen med en kurve, kan størrelsen på hvilket som helst bånd ekstrapoleres fra kurven etter å ha målt avstanden som er tilbakelagt av dette båndet i millimeter.