Innhold
Når du har kjørt DNA-prøver på en agarosegel og tatt et bilde, kan du lagre bildet for senere, på hvilket tidspunkt du kan analysere resultatene og tolke dem. Hvilke ting du leter etter vil avhenge av eksperimentets art. Hvis du for eksempel gjør DNA-fingring, vil du sammenligne størrelsen på DNA-biter fra to prøver - fra den mistenkte og fra en prøve fra et forbrytelsessted. Hvis du jobber med plasmider fra bakterier, kan du derimot sørge for at plasmidet inneholder innsatsen. Følgelig vil hvordan du tolker gelen din delvis avhenge av eksperimentet du gjorde. Likevel er det noen generelle regler du kan bruke.
Fra toppen av bildet måler du avstanden til hvert bånd i "standard" -banen til gelen din (også kalt stigen). Standardfeltet inneholder DNA-stykker hvis størrelse allerede er kjent, så du bør allerede vite størrelsen på hver før eksperimentet begynner. Mål også avstanden som båndene har tilbakelagt i hver av prøvefeltene.
Del avstanden hver standard og hvert bånd i prøvene som er reist etter avstanden til bunnen av gelen. Resultatet kalles relativ mobilitet. Du kan bruke regnearksprogrammet til å gjøre aritmetikken for deg hvis det vil gjøre dette trinnet raskere.
Angi relativ mobilitet og størrelse på hver standard i regnearksprogrammet, og bruk deretter grafikkverktøyet for regnearksprogrammer til å lage en graf av disse dataene med relativ mobilitet på x-aksen og størrelsen på y.
Monter en linje til grafen ved å bruke ikke-lineær regresjon. Ta kontakt med Hjelp-delen for regnearksprogrammer hvis du trenger å vite hvordan du gjør dette. Du bør ende opp med en ligning, kanskje en som ligner på følgende:
y = (0,3) x ^ -2,5
Merk at x her vil være den relative bevegeligheten, mens y er størrelsen. Legg også merke til at ligningen din kan ha helt forskjellige tall for eksponenten og koeffisienten - denne ligningen er bare gitt som et hypotetisk eksempel.
Ta den relative bevegeligheten for båndene fra prøven din og plugg den inn som x for å beregne størrelsen på DNA-bitene i prøvebåndene.
Anta at ligningen avledet av regnearksprogrammet ditt faktisk var y = (0,3) x ^ -2,5, og den relative mobiliteten til et bestemt prøvebånd var 0,68. Ved å erstatte 0,68 i ligningen din, finner du følgende:
y = (0,3) (0,68) ^ - 2,5
Ved hjelp av kalkulatoren din hever du 0,68 til -2,5 og finner følgende:
y = (0,3) (2,62)
y = 0,786
som da vil være den estimerte størrelsen i kilobaser av DNA i et av båndene fra prøven.
plasmider
Merk at du kanskje eller ikke trenger å bruke instruksjonene i denne delen. Agarosegelelektroforese brukes ofte for å bekrefte at et plasmid inneholder en gitt innsats. Hvis du ikke jobber med plasmider, kan du hoppe over denne delen. Hvis du er det, kan du imidlertid følge disse instruksjonene.
Legg merke til at hvis du jobber med uklippte eller hakkede plasmider, kan du ikke estimere størrelsen ved å bruke fremgangsmåten fra avsnitt 1 ovenfor. Det er fordi uklippte og nikrede plasmider vandrer i forskjellige hastigheter fra lineært DNA.
Sammenlign antall band i hver bane. Husk at et restriksjonsenzym kutter DNA på steder der en gitt sekvens kalt restriksjonssete forekommer. Hvis en prøve ble behandlet med TO restriksjonsenzymer, bør begge et bånd for innsatsen og et bånd for resten av plasmidet være tilstede. Det er fordi innsatsen vil bli flankert av to restriksjonsseter, hver for et annet enzym, så kutt på begge disse stedene vil frigjøre innsatsen fra plasmidet. Et kutt på bare ett sted, derimot, vil konvertere plasmidet til lineært DNA. Et prøvesnitt uten restriksjonsenzymer eller ett restriksjonsenzym bør da inneholde et enkelt bånd, mens et prøvesnitt med to restriksjonsenzymer bør inneholde to bånd.
Se opp for band opprettet av nicket plasmid DNA. Et hakket plasmid har bare et snitt i en enkelt streng, så det vandrer saktere enn et kuttet plasmid. Kuttede plasmider migrerer igjen saktere enn uklippet DNA.
Vurder størrelsen på innsettet ved å bruke fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 1 og bestem om det samsvarer med forventningene dine (som vil variere avhengig av eksperimentet.)